外泌体中的lncRNA，以ceRNA机制在肾细胞癌中行使功能

外泌体是近年来医学领域研究的热点，由于其由胞内分泌到胞外，含有母细胞丰富的遗传物质（DNA，RNA，蛋白等）的特性，与肿瘤转移和发展具有非常重要的作用。今天，小编和大家分享一篇发表在《Cancer cell》上的文献，来了解下外泌体中的lncRNA，怎么样通过ceRNA的机制，调控肾细胞癌的药物耐受性。

研究背景

肾细胞癌（RCC）是一种常见的实质恶性肿瘤，临床上并无明显症状。苏尼替尼（Sunitinib），一种受体酪氨酸激酶抑制剂，是最常用的肾细胞癌临床治疗选择。然而，临床数据显示，有10%-20%的病人显示出对苏尼替尼的药物抗药性，在治疗6-15个月后表现出疾病复发。苏尼替尼治疗肾细胞癌的抗药性内在分子机制是什么？本研究通过研究lncRNA，以及外泌体中lncRNA的调控机制研究，为我们展示了其内在调控过程。

研究结果

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lncARSR是苏尼替尼药物耐受的特异性lncRNA

为了探究抗药机制，研究人员首先建立了裸鼠转移模型，筛选苏尼替尼耐药性的肾细胞系7Su3rd和ACSu3rd。运用lncRNA表达谱芯片，研究人员筛选到67个药物耐受性的lncRNA。通过RT-PCR验证和病人来源异种移植(PDX)实验，范围缩小到24个。进一步分析显示，有8个是特异性上调。接下来，研究人员把这8个lncRNA都进行了shRNA敲降实验。结果显示，只有lncRNA RP11-375O18.2-001在敲降后恢复了药物敏感性。因此，研究人员命名该lncRNA为lncARSR。

接下来，通过RACE实验，Northern blot等实验验证了lncARSR的非编码特性，长度，及在病人组织中的表达情况，证实了lncARSR是一个与苏尼替尼药物耐受相关的肾细胞癌特异性高表达lncRNA。

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AKT/FOXO Axis调控lncARSR影响苏尼替尼耐药性（上游研究）

通过对lncARSR的生物信息学分析，研究人员发现在其启动子区域有FOXO1和FOXO3a的结合位点。细胞系转化实验表明，持续的激活FOXO1或FOXO3a可以明显减低lncARSR的表达。通过ChIP等实验验证，FOXO1或FOXO3a也确实能够结合到lncARSR的启动子区域。已有研究表明，AKT可以诱导磷酸化和胞质停留而调控FOXO家族的蛋白降解过程。敲降AKT后发现，lncARSR的表达受到抑制。因此， AKT通过激活FOXO1和FOXO3a，上调lncARSR，影响了肾细胞癌的药物抗药性。

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lncARSR是肾细胞癌药物耐受必需的

为了进一步确认lncARSR的耐药性，研究人员对耐药细胞株中敲降lncARSR，检测细胞生长和相关基因表达。结果显示，细胞变得药物敏感。同时，STAT3，AKT和ERK信号表达受到抑制。因此，在耐受细胞中，抑制lncARSR的表达能恢复药物的敏感性。异位移植检测也表明，敲降后药物治疗4个月后也不会复发。因此，lncARSR是肾细胞癌苏尼替尼药物耐受必需的。

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血浆和肿瘤组织中lncARSR的表达水平与病人的药物耐受相关

为了检测lncARSR是否能在胞外环境中存在，研究人员在RCC细胞系培养基（CM）和病人血浆进行了检测。结果显示，CM中的表达和血浆中的表达分别与细胞中和组织中的表达相关。此外，手术切除后，血浆中的lncARSR的表达又降低，而发生复发时，表达量又增加了。因此，血浆中的lncARSR可能主要是由肿瘤细胞产生。

血浆中游离的lncARSR是否能预测病人的药物反应？结果显示，具有进行性的病人（progressive disease PD）治疗前，lncARSR表达比non-PD高。Kaplan-Meier分析显示，高的lncARSR病人在苏尼替尼治疗后会表现出减少的过程生存（progression-free survival PFS），而这种现象在转移组中表现更加密切。进一步的分析显示，血浆的lncARSR检测可作为苏尼替尼治疗效果的预测因子。

另外，研究人员对肿瘤组织中lncARSR的表达与药物敏感性进行相关性分析。结果显示，高表达病人会表现出苏尼替尼治疗效果差的情况。因此，lncARSR在组织中的表达情况也是药物治疗是否有效的预测因子。

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hnRNPA2B1调控lncARSR的外泌体包装过程 

前面研究表明lncARSR在胞外存在，是否是游离的？通过RNase和Triton-X-100处理，发现只有在两种试剂都处理情况下才会降低，暗示lncARSR不是直接游离的。通过分离CM中的外泌体，研究人员发现lncARSR广泛存在。另外，抗药细胞系外泌体中也高表达lncARSR。

LncARSR是否是特异性的包装到外泌体中呢？研究人员通过RNA pull down实验表明hnRNPA2B1（已报道和外泌体包装相关）能结合lncARSR。为了进一步确认其结合关系，研究人员用RIP进行检测，发现其广泛存在于细胞质和外泌体中。通过在抗药细胞系中敲降hnRNPA2B1，发现外泌体中的lncARSR减少。因此，hnRNPA2B1参与lncARSR的外泌体装配过程。

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胞外转移外泌体传播苏尼替尼抗药性

细胞分泌外泌体，通过与受体细胞结合传递信号，影响细胞的活性。因此，研究人员进行了共培养实验。结果显示，只要有一个细胞中存在高表达的lncARSR，并能正常分泌外泌体，共培养后本来不抗药的细胞系也会存活下来。因此，抗药细胞可以通过在外泌体中传递lncARSR影响相关细胞的抗药性。

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AXL和c-MET与lncARSR调控的耐药性相关（下游研究）

已有研究表明，RTKs与药物耐受相关。因此，研究人员对RTKs进行了筛选，发现AXL和c-MET的表达会在lncARSR敲降后降低，而在抗药模型中，AXL和c-MET的表达比较高。当敲降AXL和c-MET后会抵消掉lncARSR敲降对药物敏感的恢复。当用AXL和c-MET的小分子抑制剂BMS777607处理，也能恢复lncARSR高表达引起的抗药性。因此，AXL和c-MET位于lncARSR下游调控苏尼替尼抗药性。

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lncARSR作为ceRNA分子调控AXL和c-MET的表达

通过生物信息学分析和实验验证，研究人员发现lncARSR和AXL及c-MET的3’UTR区域都包含有miR-34及miR-449结合位点，因此，lncARSR对AXL和c-MET的调控可能是一种ceRNA调控机制。

RIP和荧光素酶报告实验表明miR-34/449确实能结合到lncARSR，影响其表达。而当lncARSR敲降后，AXL和c-MET的表达也会因为miR-34a的增多而表达下降。因此，lncARSR通过ceRNA机制，借助miR-34/449来影响AXL和c-MET的表达。

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靶向lncARSR能恢复肾细胞癌的抗药性

为了寻找肾细胞癌抗药性的治疗方法，研究人员用LNA技术（锁核酸）处理抗药性细胞移植小鼠。结果显示，药物敏感性恢复，肿瘤慢慢变小。进一步检测也显示，AXL和c-MET表达降低。进一步的体内实验和BSM777607处理也显示，苏尼替尼抗药性会得到恢复。因此，靶向lncARSR或者AXL和c-MET能够作为潜在的苏尼替尼抗药病人治疗靶点。

小编点评

该研究通过对肾细胞癌苏尼替尼抗药性的研究，发现了抗药特异非编码RNA-lncARSR，进一步的实验找到了lncARSR的上游调控因子FOXOs，通过外泌体的形式传递抗药性。此外，lncARSR以ceRNA的调控机制，通过结合miR-34/449影响下游AXL和c-MET的表达。该研究为理解和治疗在肾细胞中苏尼替尼的抗药性提供了理论依据。